一、研究内容

（一）研究背景

当前，器官短缺危机日益严峻，异种移植（跨物种器官移植）作为缓解该危机的潜在策略重新受到关注。在猪到人心脏和肾脏异种移植领域，已取得显著进展，在临床前和早期临床环境中证明了技术可行性及维持器官功能的能力，但猪到人肺异种移植的发展却相对滞后。

非人灵长类动物（NHP）模型的临床前研究表明，基因修饰的猪肺可能延长移植物存活时间并减少免疫并发症。然而，人类与旧大陆非人灵长类动物在Neu5Gc表达上存在物种特异性差异，这可能导致两者对CMAH敲除猪器官产生不同的免疫反应，使得旧大陆非人灵长类动物模型对人类免疫反应的预测价值存疑。此外，缺乏在脑死亡人类受者中开展基因编辑猪肺移植的相关研究，关于能否完全避免超急性排斥反应以及人类免疫系统对基因修饰猪肺如何反应等关键问题尚未得到解答，因此开展本研究具有重要的现实意义。

（二）研究设计

• 供体猪：选用22月龄、体重70kg的中国巴马香猪，其肺经过六基因编辑。通过CRISPR-Cas9 技术敲除负责产生激活人类免疫反应异种抗原的GGTA1、B4GALNT2和CMAH基因，同时插入人类补体调节基因CD55、CD46和TBM，并培育出稳定的F1代，确保其适合临床应用。供体猪饲养在严格的生物安全管理体系下，术前进行针对性病原微生物筛查，以保障微生物安全。

• 受者：为一名39岁脑死亡男性，因脑出血和脑疝已处于脑死亡状态16天，经四次临床评估确认脑死亡，且因不符合《人体器官捐献和移植条例》第36条（无直系亲属），被中国人体器官捐献管理中心排除器官捐献资格。

• 手术操作：2024年5月15日进行移植手术，供体猪左肺从获取到再灌注的冷缺血时间为206分钟。采用标准手术技术，将猪左肺移植到受者体内，包括左支气管、左肺静脉（LPV）和左肺动脉（LPA）的吻合。术中通过双腔气管插管机械通气提供呼吸支持，以防止术中低氧血症或循环不稳定。

• 监测指标：监测期为216小时，主要监测指标包括：生理参数（体温、中心静脉压、尿量、血糖、心率、血压、液体平衡和引流量等）、移植物功能（肺顺应性、血气分析等）、免疫状态（免疫细胞、炎症细胞因子、抗体水平等）以及病原微生物情况（通过宏基因组和宏转录组分析检测猪源病原体）。同时，在再灌注后2小时、24小时，术后第2天、3天、4天、6天和9天进行定期病理活检，评估移植肺的损伤和功能状态。

• 诱导治疗：术前1天给予25mg兔抗胸腺细胞球蛋白（rATG）、0.5mg吗替麦考酚酯（MMF）和5mg他克莫司（FK）；移植当天给予50mg rATG和20mg巴利昔单抗；术后第1天给予300mg利妥昔单抗；术后第2天给予600mg依库珠单抗和50mg托法替尼；术后第3天再次给予20mg巴利昔单抗；术后第6天给予250mg贝拉西普。

• 维持治疗：他克莫司（FK506）5mg/天；吗替麦考酚酯术后第0天1g/天，第1天增至2g/天，第2天增至2.5g/天，并从第3天到第9天维持在2.5g/天；甲泼尼龙术后第0天750mg，随后逐渐减量至40mg/天。术后监测他克莫司血药浓度，维持在15-20ng/ml。

实验流程

（三）研究结果

• 整个术后监测期内，受者的动态生理和血流动力学参数保持稳定，表明受者在216 小时观察期内生理稳定且内环境平衡。

• 再灌注后，猪肺表现出良好的存活能力和顺应性，左肺血管血气测量显示氧分压达到100mmHg（吸入氧分数40%）。

• 术后6小时和24小时的胸部X线片显示移植肺透明度降低；术后24小时计算机断层扫描（CT）显示移植肺背侧区域实变，符合严重的原发性移植物功能障碍（PGD），而肺前部保持良好透明度。

术后X线片及胸腔左右侧面积之比

• 炎症反应：再灌注后24小时，移植肺出现严重水肿，伴有CD68阳性细胞浸润，类似PGD损伤。术后监测炎症标志物和细胞因子发现，细胞因子（尤其是白细胞介素-6（IL-6）和IL-10）显著升高，表明机体对异种移植物产生了活跃的炎症反应。术后早期T细胞、B细胞和自然杀伤细胞数量波动，且T细胞从术后第3天开始逐渐增加。

• 抗体与补体激活：术后第3天和第6天，移植肺肺泡间隔出现明显的免疫球蛋白G（IgG）线性和团块状沉积，提示抗体介导的损伤；到第9天，IgG沉积减少，表明体液免疫反应部分缓解。而免疫球蛋白M（IgM）在早期染色较弱，到第9天呈明显阳性，提示延迟性IgM反应。补体激活方面，从术后第3天开始可检测到C4d沉积， 且在第6天和第9天逐渐增强；C3d仅在第3天出现微弱且散在的阳性。

• 血清抗体动态变化：移植后总血清IgM和IgG水平下降，且IgM下降幅度大于IgG。抗供体猪特异性IgM在术后早期下降，在第3天左右达到最低点，第6天后开始上升，提示二次免疫激活；抗供体IgG从第3天到第7天稳步上升，在第7天到第9天趋于稳定，表明体液免疫进入平台期。经总Ig水平校正后的数据显示，早期IgM 和IgG比例变化不大，第6天后显著上升。
  
  

• 病原微生物监测：术前供体肺检测到低水平的猪淋巴otropic疱疹病毒-1（PLHV-1）和PLHV-3；术后受者血液中检测到单个PLHV-1 DNA读数，移植肺中未检测到。所有检测样本中猪内源性逆转录病毒-C（PERV-C）均为阴性。

• 供体外周血中检测到细菌DNA（如马葡萄球菌和田野棒状杆菌），而移植前肺中未检测到。此外，受者外周血中的感染标志物降钙素原和C反应蛋白呈下降趋势，表明移植后无活动性感染。

术后免疫组化结果

二、小结

• 器官排斥问题：尽管避免了超急性排斥反应，但仍出现了原发性移植物功能障碍和抗体介导的排斥反应，且在人类体内观察到的体液免疫反应比非人灵长类动物模型中更强烈、发生更早，如何进一步优化免疫抑制策略以有效控制各类排斥反应，仍是亟待解决的关键问题。移植物功能障碍

• 移植物功能障碍：术后出现的类似原发性移植物功能障碍的严重水肿，可能与缺血再灌注损伤以及猪 - 人凝血功能不协调有关，提示在肺保存、手术操作以及改善凝血兼容性等方面仍需改进。研究设计局限性

• 研究设计局限性：受者体内存在原生肺，可能对移植物功能和免疫反应产生影响，难以评估单肺异种移植模型的长期存活能力；免疫抑制方案中未采用 CD40 和 CD40L 阻断，限制了免疫抑制效果；术前交叉配型虽呈阳性，但事后分析显示校正后的抗供体 Ig 水平相对较低，表明异种交叉配型的预测价值有限，且目前尚无标准化的异种交叉配型阈值，不利于受者选择。

• 优化基因编辑策略：进一步探索新的基因编辑靶点，如加入 EPCR、HO-1 等基因，以增强移植肺对缺血再灌注损伤的耐受性，改善凝血兼容性，减少免疫原性。改进免疫抑制方案

• 改进免疫抑制方案：整合 CD40 和 CD40L 刺激阻断、增强补体（如 CD59）和细胞因子（如 IL-6 的托珠单抗）抑制等策略，开发更针对肺免疫特点的精准免疫抑制方案。完善临床前研究

• 完善临床前研究：开展更多单肺异种移植的动物模型研究，评估长期移植物存活情况；建立标准化的异种交叉配型阈值和受者选择标准；加强对猪源病原体的长期监测和防控研究，确保异种移植的安全性。推进临床转化研究

• 推进临床转化研究：在解决上述关键问题的基础上，逐步开展小规模、短期的临床探索研究，积累更多在人类体内的研究数据，为肺异种移植技术最终应用于临床，缓解器官短缺危机奠定坚实基础。

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